Reproduktif Biyoteknoloji (Yardımcı Üreme Teknikleri)

EKZOJEN HORMON KULLANIMLARI

Çağdaş hayvan yetiştiriciliğinde başlıca hedefler; yüksek verimli genotipleri korumak ve yaygınlaştırmak, döl verimini en yüksek düzeyde tutmak ve hayvan materyali ile yetiştirme olanaklarından azami ölçüde yararlanmak şeklinde özetlenebilir. Böylece birim hayvan başına daha çok yavru elde etmek , yıl içinde birden fazla doğum sağlamak, yaşam süresinde daha çok yavru yetiştirmek, erkek hayvanların daha verimli bir şekilde değerlendirilmelerini sağlamak, kaliteli ve bir örnek yavrulara sahip olmak ve yavru kayıplarını en aza indirilebilir. Çiftlik hayvanlarında ekzojen hormon kullanımı :

 

     Seksüel senkronizasyon

     Presynch – ovsynch

     Ovulasyon şansının arttırılması ve ikizlilik oranın yükseltmek

     Süperfolikülasyon, süperovulasyon

     Genç hayvanlardan erken yaşta döl alınması

     Gebelik süresinin kısaltmak ( doğumun indüklenmesi )

 

1. a)     Seksüel senkronizasyon ( Östrüsun uyarılması )

Östrus ve ovulasyonun istenilen zamana göre planlanması işlemine seksüel senkronizasyon adı verilmektedir. Seksüel senkronizasyonun amacı; östrusları kısa bir süre içine toplamak, tohumlama ve aşımları planlanan zaman içinde yapmak; suni tohumlama ve embriyo nakli uygulamalarını kolaylaştırmak; ilk tohumlamada gebe kalmayan hayvanların izleme sorununu gidermek, gebe hayvanlarda grup halinde yem değişiklikleri; aşılama ve antiparaziter ilaç uygulamalarını kolaylaştırmak, dogumları belli zaman diliminde yaptırıp, denetleyebilmek yavru kayıplarını azaltarak pazara bir örnek yavrular verebilmek, barınak, işgücü ve malzemelerin daha verimli bir şekilde kullanılmaları sağlanabilir.

Seksüel senkronizasyon için pratikte: prostegenler, östrogenler, PGF₂α ve analogları PMSG (ECG), GNRH, HCG gibi ganodotropinler, melotonin gibi hormonlar veya bunların kombinasyonları kullanılmalıdır.

PGF₂α ve analoglarının (PG) kullanılması :

Seksüel siklusun luteal evresinde (6-16.günler) bulunan büyük ruminantlarda tek siklik dönemi bilinmeyen hayvanlarda 11 gün ara ile iki defa uygulanan PG enjeksiyonlarını takiben  2-5 gün içinde östrus belirtileri şekillenir ve bunu ovulasyon izler. Büyük ruminantlarda PG uygulamaları 4 farklı yöntem önerilebilir;

1. Bu yöntemde ;11 gün ara ile iki PG enjeksiyonudur. Önceden ve enjeksiyonlar arasında gözlem gerekmez, ilkinde hangi siklik dönemde olursa olsun, ikinci enjeksiyon sırasında bütün hayvanlar diöstrus evresindedir ve PG enjeksiyonuna cevap verirler.
2. Bu yöntemde ; hayvan bakıcısı 5 gün süre ile günde 3 defa östrus belirtileri gözlemeli ve östrus gösterenleri tohumlatmalıdır. Bu süre içinde östrus göstermeyenlere ise 6 günde PG enjekte edilir ve 3 gün içinde östrus görülür.

3. yöntemde ise ilk iki yöntemin kombinasyonu şeklinde düşünülebilir. Önce tüm ineklere bir kere PG enjekte edilir. Yedi gün süreyle östrus semptpmları gösteren hayvanlar tohumlanır. Semptom göstermeyen hayvanlara sekizinci gününde ikinci PG enjeksiyonu yapılarak, izleyen üç gün içinde östrüslar belirlenebilir.
4. yöntemde ise PG enjeksiyonundan önce hayvana rektal palpasyon / ultrasonagrafi yapılarak veya hızlı progesteron testi ile süt-kan progesteron düzeyi araşyırılarak ovaryumlarında aktif korpus luteum bulunanlara enjeksiyon için hemen bütün hayvanlar PG’e cevap verirler

 

Progestegenlerin kullanılması :

 

Progestagenlerle senkronize edilecek hayvanlarda buzağılamanın üstünden en az 20 gün geçmiş olmasına ve herhangi bir genital _üriner enfeksiyonun bulunmamasına özen gösterilmelidir.

Büyük ruminantlarda progestagenler sıklıkla, progesteron salan intravaginal spiral (PRİD) veya kulak deri altına yerleştirilen implant formunda uygulanmaktadır. Fertil bir östrus oluşturabilmek için vaginal PRİD 10 – 20 gün, implant ise 9 – 10 gün süre ile uygulanmaktadır. Progestagen uygulanmasının bittiği gün ineklere 500 IU. eCG enjeksiyonu foliküler gelişmeyi uyarması bakımından yararlı olabilir.

 

2- Ovsynch – Presynch

 

Senkronize edilecek hayvanların ovulasyon zamanını bir araya getirme işlemidir. Yani, ovulasyonların istenilen zamanda gerçekleşmesi için yapılan çalışmalardır.

Ovsynch uygulaması senkronizasyon işleminden daha hassas olarak ovulasyon istenilen zamana getirmesi amaçlanmıştır. Bu işlemi yapmak için senkronize edilecek hayvanların;

    0. gün tek doz GnRH

    7. gün tek doz PGF_2α

    9. gün tek doz GnRH

    10. gün suni tohumlama yapılarak ovsynch işlemi tamamlanmış olur.

Presynch uygulaması da senkronizasyon ve ovsynch uygulamalarının her ikisinin de bir arada yapılmasıdır. Hayvanlar önceden senkronize edilerek ve daha sonra ovsynch uygulaması yapılarak çok daha hassas bir östrus programı oluşturulur. Böylece daha fazla oranda gebelik elde edilecektir. Çünkü senkronize edilen bütün hayvanların ovulasyonlarını istenilen zamanda olmasıyla tohumlamalardan en yüksek oran tutturulmuş olacaktır.

 

3- Ovulasyon şansının artırılması ve ikizlik oranının yükseltilmesi

 

İkiz yavru yapma oranı yüksek olması normalde kalıtsal bir özelliktir. Uyarma yöntemi ile ikizliğin yükseltilmesi yoluna daha çok koyun ve keçilerde uygulanabilmektedir. Çünkü ineklerde ikizlik pek tercih edilmez iken; kısraklarda ikizlik, erken embriyonik ölüm yüksekliği, doğa bilen yavruların yeterince gelişmemiş olmaları ve yaşama şanslarının düşük olması gibi nedenlerle istenmeyen bir özelliktir.

Bu amaçla eCG(PMSG) veya FSH enjeksiyonlarına başvurulmaktadır. Ancak eCG hormonunun yarılanma ömrünün uzun olması nedeni ile daha çok tercih edilmektedir. eCG hormonu koyunlarda doğal siklusun 12 – 13. gününde, senkronize sikluslarda ise uygulamanın sona erdiği günde hayvanların iriliğine göre 600 – 1000 IU.(İM) enjekte edilerek kuzu sayısı %35 – 70 artırılabilir.

İneklerde ise siklusun erken luteal döneminde( 5 – 6. günleri ) 1500IU. eCG verildikten sonra 16 – 18. günlerdeki foliküler dönemde 2000IU. eCG ve östrus sırasında da 100mcg. GnRH enjekte edilerek  %30’un üstünde çoğul gebelik elde edilebilir.

PMSG ( eCG ) hormonu, ikizliğin uyarılması, anöstrus ve sezona geçiş dönemindeki koyunlarda ovaryumların uyarılması amacı ile kullanılmaktadır.

	PMSG’nin evcil hayvanlarda uygulanan dozları
Tür	Endikasyonları	Dozu
İnek	Süperovulasyon	2000 – 3000IU
	Süperovulasyon	1200 – 1500IU
Koyun	İkizliğin uyarılması	600 – 1000IU
	Şişeklerde östrusun uyarılması	400 – 600IU
	Koyunlarda östrusun uyarılması	600 – 800IU
Köpek	Östrusların uyarılması	500IU ( 8 – 9 gün )
Kedi	Östrusların uyarılması	100IU ilk doz ve 25×100IU 7 gün

 

4- Süperovulasyon ve Süperfolikülasyon

 

Hayvanlara ekzojen hormon enjekte edilerek ovaryumlarında çok sayıda folikül gelişiminin sağlanması ve ovulasyonun oluşturulması şeklinde tanımlanabilir. Süperovulasyon sonrası hayvanların ovaryumlarında östsus sırasında bir yerine ortalama on adet folikül gelişir ve ovulasyon şekillenir.

Süperovulasyon için eCG , FSH, at hipofizer gonodotropini ve human menopasual gonodotropini kullanılmaktadır.

Günümüzde süperovulasyon amacı ile PG’ler ve PMSG/FSH’nın birlikte kullanıldığı siklus ortası stimulaston yöntemi kullanılmaktadır. Bu amaçla tek doz PMSG yada dört gün süre ile günde iki kez FSH uygulamaları yapılır. Bu uygulamanın üçüncü gününde PG enjeksiyonu yapılır. Prostaglandin enjeksiyonundan 48 saat sonra östrus gözlenmektedir.

 

5- Genç hayvanlarda erken yaşta döl alınması

 

Düvelerin ergin ağırlıklarının 2/3’üne ulaşmadan gebe bırakılmaları bir çok yönden sakıncalıdır. Kuzukar ise kalıtım, besleme ve doğum tarihlerine bağlı olmakla birlikte ortalama 9 ay çevresinde pubertasa ulaşırlar. Bu hayvanlara 10 – 14 gün süre ile progestagenler uygulanıp son gün 400 – 600IU eCG enjekte edilerek aşımlar 2 – 3 ay öncesine alınabilir. Anılan yöntemle kuzuların %70 – 100’ü östrus gösterip yarısından fazlası gebe kalabilir. Ancak erken gebe bırakma sonunda döl verimi oranı düşük, atık ve zayıf kuzu yüksek ve doğum sırasında kayıplar fazla olmaktadır.

6- Gebelik süresinin kısaltılması

Çiftlik hayvanlarında gebelik süresi tamamlanmadan doğumun uyarılması amacı ile

glukokortikoidler ve PG’ler kombine olarak kullanılmaktadır. Bu şekilde doğumu uyarılan ineklerde postpartum sorunlar ve infertilite oranı yüksek olmaktadır. Bazı çalışmalarda birkaç günlük erken doğumun koyunlarda postpartum sorun oluşturmadığı bildirilmiş olmasına rağmen anılan uygulamanın ekonomik yararları düşündürücüdür.

SUNİ TOHUMLAMA UYGULAMALARI

             Suni tohumlama; uygun tohumlama zamanında olduğu belirlenen dişilere, uygun şekilde hazırlanmış sperma porsiyonlarının dişi genital kanala nakledilmesidir. Suni tohumlamanın amacı;

        Damızlık değeri yüksek olan erkek hayvanlardan olabildiğince fazla yararlanabilmek

        Çiftleşme ile bulaşan hastalıkları kontrol altına almak

        Östrusları belirlenen dişilere zaman kaybetmeden tohumlamalarını sağlamak olarak düşünülebilir.

 

     Spermanın elde edilmesi 

Sperma farlı şekil ve yöntemler ile alınabilmektedir. Kullanılan yöntemlerin içerisinde suni vagina ile sperma almanın üstünlüğü diğerlerine oranla tartışma götürmemektedir. Diğer yöntemler muayene ve bilimsel amaçlı kullanılmaktadır. En çok kullanılan sperma alma yöntemleri;

      Suni vagina kullanılması

      Elektroejakulasyon yöntemi

      Ampullanın masajı ile sperma alma

      Prezervatif yöntemi

      Vaginaya bırakılan spermanın geri alınması

      Epididimisin punksiyonu

      Kesimhanelerden temin edilen testislerin epididimislerinin punksiyonu

 

   Spermanın muayenesi

Farklı şekil ve yöntemler ile yapılacak tohumlamalardan elde edilecek fertilite oranı hakkında önceden fikir edinmek büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle sperma laboratuar koşullarında bir dizi muayeneden geçirilir. Bunlara spermatolojik testler adı verilmektedir. Testler neticesinde spermanın potansiyel fertilitesi hakkında önceden bilgi edinilmiş olunur.

 

1-     Makroskobik muayene

 

Spermanın dış bakıda gözle muayenesi demektir. Hacim, renk, kıvam ve kitle hareketi(MASS – Aktivite)’nin  yanı sıra koku muayenesini de bu grupta incelemek mümkündür.

 

 

2-     Mikroskobik muayene 

 

Sulandırılmamış olan spermanın mikroskop altında kitle hareketi, spermatozoonların motilitesi ve spermatozoonların yoğunluğu incelenmektedir.

3-     Morfolojik muayene

 

Spermatozoonların mikroskobik bakıda morfolojilerinin incelenmesi spermanın potansiyel fertilitesini değerlendirmede önemli testlerdendir. Anormal yapıdaki spermatozoonların fertilizasyon güçleri yoktur. Sağlıklı bir spermada her zaman morfolojik bozukluklara rastlanabilir ancak bunların oranı önemlidir. %20’den fazla morfolojik bozukluk saptanan spermalar kullanılmamadır. Günümüzde morfolojik bozukluğun lokalize olduğu yere göre sınıflandırılması yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunlar;

 

        Akrozomal bozukluklar

        Başa ait bozukluklar

        İmplantasyon çukurluğuna ait bozukluklar

        Başın orta bölüme bağlanması ile ilgili bozukluklar

        Orta bölüme ait bozukluklar

        Kuyruk bozuklukları

 

4-     Ölü ve canlı sperma sayımı

 

Sperma ile yapılan frotilerin  eozin – nigrosin vital boyama yöntemi ile boyanarak ortamdaki canlı ve ölü spermaların sayı  tespit edilir.

 

    Spermamın sulandırılması

 

Spermanın 5°C’de saklanması veya dondurulmasıda ani ısı değişikliklerinden koruyabilmek, canlılığını uzun süre devam ettirmek, potansiyel fertilitesini koruyabilmek, çeşitli bakterilerin spermatozoonlara zarar vermesini önlemek ve alınan 4 – 6ml oranlardaki spermadan 100 – 500 eşit hacme bölmek için kullanılırlar. Günümüze değin yumurta sarısı – sodyum sitrat, TRİS, süt, süt tozu gibi değişik sulandırıcılar kullanılmiştır.

 

      Spermanın saklanması

 

Suni tohumlama tekniğinin ilk uygulandığı yıllarda alınan spermalar taze olarak zaman geçirmeden tohumlamada kullanılıyordu. Spermanı kısa sürede kullanılması zorunluluğu beraberinde uygulamada kısaltmalar getiriyordu.

Spermanın uzun süre muhafazası için 5°C’de saklama teknikleri geliştirilmiştir. Ancak 2 – 3 gün gibi kısa süreli olan bu tekniğin yerine daha düşük ısılarda saklama teknikleri geliştirilmiştir.

Özet olarak uygun sulandırıcılar ile işlem görmüş boğa spermasının 5°C’de veya düşük ısılarda ( deep – freezing )saklamak mümkündür.

Spremanın düşük ısılarda saklanabilmesi için değişik yöntemler geliştirilmiştir. Bunlardan palet, pellet ve ampul yöntemi kullanılmaktadır. Rutin olarak kullanılan payet ile saklamadır. Sperma 0.25 veya 0.5ml hacimli payetlerin içine gerekli sulandırıcılar konulduktan sonra sıvı azotun içinde saklanmasıdır.

 

Donmuş spermanın eritilmesi ve uygulanması

 

Dondurulmuş spermanın eritme işlemi istenilen düzeyde elde edilmesi için önemli bir aşamadır. Eritme sırasında uygulanan ısı ve sürelere karşı spermatazoonlar oldukça duyarlıdır. Yapılan araştırmalar sonucunda payetler için en uygun ısı ve süre saptanmıştır. 35 – 38°C’deki su banyosunda 30 sn’de eritilirler.

37°C’deki eritilen sperma tohumlama kateterine yerleştirilirler. Kateterdeki veya ortamdaki büyük ısı farklılıkları özellikle akrozomda irreversible bozukluklar oluşturabilir. Eritme işlemi tohumlanacak ineğe mümkün olduğu kadar yakın bir yerde yapılmalıdır. Kateterdeki ısı farkını azaltmak için daha önceden ısıtılmalıdır.( koltuk altı ) tohumlama zamanı gelmiş olan hayvanların tohumlamasında katetere yerleştirilen sperma uygun tohumlama yöntemiyle spermanın dişi genital kanala bırakılmasıyla gercekleştirilir. Tohumlama yöntemi olarak;

        Rekto – vaginal tohumlama

        Basit vaginal tohumlama

        Elin vaginaya sokulması yardımı ile intra servical tohumlama

        Spekulum yöntemi ile intra servical tohumlama

        Servix pensi – spekulum kullanılarak intraservical tohumlama

Uygun tohumlama yöntemi ile dişi genital kanala bırakılan spermatazoonlar dölleme kabiliyetine sahip değildirler dölleme kabiliyetini dişi genital kanalda geçirmiş olduğu 6 saat gibi bir sürede kazanırlar. Bu geçirmiş oldukları sürede dölleme yeteneklerini yani kapasitasyon yeteneğini kazanırlar .

İnvitro ortamda spermatazoonların kapasite olması için glikoaminoglikan ve heparin benzeri maddelerin bulunduğu bir vasat içerisinde spermatazoonlar 6 saat içerisinde kapasite olurlar.

 

 

          3)  Embriyo  Teknolojileri

 

     Embriyo Transferi (ET)

     Oosit eldesi ve Ovum Pick-up (OPU)

     Erkek eşey hücrelerinin eldesi (TESA, MESA) ve hazırlanması (IVSC)

     Oositlerin in vitro maturasyonu (IVM)

     Alternatif Yöntemler (ME, MM, ICSI, SZI, ZD, PZD, PGD, NT)

     Embriyo sexing

     Klonlama

 

Embriyo Transferi (ET)

 

Verici (donor) bir dişi hayvanın uterusundan, erken aşamadaki embriyoların, senkronize edilmiş taşıyıcı (recipient) dişi hayvanlara nakledilmesi olarak tanımlanır.

Amaç :

     Üstün nitelikli dişi hayvanlardan çok sayıda yavru alınması

     infertil bazı hayvanlardan yavru alınması

     Embriyolar dondurularak yıllarca saklanarak, taşınabilmesi,

     ikizlik oranının artırılması,

     Sütçü ırk hayvanlardan etçi ırk yavru elde edilmesi,

     Araştırmalar için identik yavruların elde edilmesi,

     Taşıyıcı annelerden doğan yavruların bölgesel bağışıklık kazanması.

 

Nasıl yapılır ?

     Verici ve taşıyıcı hayvanlar seçilir

     Verici hayvanlarda süperfollikülasyon ve süperovulasyon uygulanır

     Verici ve taşyıcı hayvanların senkronizasyonu sağlanır.

     Verici hayvanlar tohumlanır.

     Vasat ve diğer malzemelerin hazırlanır.

     Vericilerden embriyolar toplanır.

     Embriyolar değerlendirilir, dondurularak saklanır.

     Embriyolar taşıyıcı hayvanlara nakledilir

 

Verici Hayvanların Seçimi

 

     Bir ya da iki tohumlamada gebe kalmış

     Her yıl düzenli ve normal doğum yapmış

     Normal östrus siklusu gösteren

     Kistik ovarium dejenerasyon sorunu olmayan

     Güç doğum ve retensiyo sekundinarum rastlantısı olmayan

     Brusellosis, tüberkulosis, leptosiprosis, anaplazmosis, vibriosis, trikomonasis, mavi dil gibi hastalıkları bulunmayan inekler seçilir.

Vasat ve Diğer Malzemelerin Hazırlanması

Başlıca iki vasat kullanılmaktadır. TCM-199(Tissue Culture Medyum) ve modifiye PBS. Bu vasatlar piyasada hazır olarak bulunabildiği gibi kolaylıkla hazırlanabilen toz şeklindedir. Malzemeler ise sterilze edilir. Cam malzemeleri strilize etmek için otoklav, plastik malzemeler için etilen dioksit gazı kullanılır.

Vericilerden Embriyolar Toplanması

Embriyoların elde edilmesinde iki yöntem vardır. İlki operatif olarak embriyoların eldesi. Bu yöntem operasyonla oviduktaki ebriyoların alınması şeklindedir. Maliyetin yüksek olması ve postoperatif dönemde adezyonların şekillenmesi yüzünden kullanılmaz. İkincisi ise yıkama tekniğidir. Bu teknikte foley kateteri kullanılır. Yıkama işlemi ilk tohumlamadan sonra 5-8. günlerinde tercihen 7. günde yapılır. Balonlu foley kateteri ile serviks geçildikten sonra, balon kısmı bifurkasyo bölgesinden 2-3 cm kadar öne gelecek şekilde yerleştirilir. 15-20 ml hava verilerek şişirilir. Uterus içindeki kateter Rektal yolla, yerleştirilen kişi tarafından kontrol edilir. Yaklaşık 250 ml modifiye PBS yıkama vasatıyla uterus yıkanır. Bir kornuya 30-150 ml yıkama vasatı verilir. Yıkama işlemi bitince uterusa antibiyotik veya iyot solüsyonu verilir.

Embriyoların Değerlendirilmesi

Yıkantı 25- 25 ⁰C de  bir odada veya 37-39 ⁰C’de inkubatörde 30-45 dakika süreyle bekletilir. Üst kısım atılır, alttaki kısım karıştırılır ve 4-5 adet petriye konarak incelenir. Bulunan embriyolar %20’lik BSA içeren taze kültür vasatına aktarılır. Döllenmemiş oositler ayrılır. Embriyoların dondurulmasında vitrifikasyon ve yavaş dondurma teknikleri vardır.

 

Embriyo Nakli

Senkronize edilmiş alıcılara nakledilirler. Alıcı ve verici hayvan arasında 24 saatlik senkronizasyon farklılıkları normal kabul edilir. Operasyonla uterus lümenine veya tohumlama kateteri ile payetlere yerleştirilmiş olan embriyolar uterusa bırakılır.

    Oosit eldesi ve Ovum Pick-Up (OPU)

Embriyo teknolojisi uygulamalarında kullanılmak ve gen kaynaklarının korunması amacı ile oositlerin uygun yöntemler ile elde edilmesi gerekmektedir.

Oositler post mortem elde edilebileceği gibi, OPU tekniği ile de canlı hayvanlardan elde edilebilmektedir.

Ayrıca gelecekte endoskopik yöntemler aracılığı ile follikül aspirasyonu ve oosit eldesi mümkün görülmektedir.

OPU uygulanacak olan hayvana önce sedasyon, epidural anestezi ve özellikle kısraklarda rektum relaksasyonu sağlanır.

Özel aspirasyon iğnesi ve kılavuz sistemli 6-7,5 MHz’lik vaginal sektör prob ile servikse kadar ilerlenir.

Rektal olarak yakalanan ovariumlar görüş alanına getirilerek proba yaklaştırılır.

Probun kılavuz sisteme göre ayarlanması sonrasında aspirasyon iğnesi (16–19 g, 50-60 cm) ile follikülere girilir.

Yıkama veya sadece aspirasyon ile follikül sıvısı ile birlikte oositler 50 ml’lik steril enjektörlere veya 200 mm Hg basınçlı vakum pompaları sayesinde özel steril tüplere alınır.

Elde edilen oositler PBS+heparin+buzağı serumu+penisilin G/streptomisin karışımı içerisinde 37-39 ⁰C’de korunarak laboratuara iletilir.

 

Sperm eldesi ve hazırlanması (ejakulasyon, TESA, MESA)

 

Erkek eşey hücreleri klasik olarak suni vajen yardımı ile ejakulasyon ile elde edilebileceği gibi, Testiküler sperm aspirasyonu (TESA) ve Mikrocerrahi epididimal sperm aspirasyonu (MESA) yöntemleri ile elde edilebilir.

Sperm eldesi ve hazırlanması (IVSC)

Ancak Veteriner Reproduktif Biyoteknoloji uygulamalarında dondurulmuş ticari sperma kolaylıkla kullanılabilmektedir.

Bununla birlikte çözdürülen sperma içindeki eşey hücrelerinin kapasitasyonu ve akrozomal reaksiyonlarının uyarılması gerekir.

Bu nedenle In Vitro Sperm Capacitation (IVSC) prosedürü geliştirilmiştir.

     Dondurulmuş ticari payet içindeki sperma çözdürülür.

     Santrifüj tüpü içinde 2’şer ml hacimli %45’lik ve %30’luk percoll solusyonları üzerine 2 ml sperma eklenir.

     Percoll solusyonu ile birlikte 500 g, 10 dak. süre ile bir kez yıkanır.

     Co2’li incubatörde 39⁰C’da 6-8 saat incube edilir.

 

Oositlerin in vitro maturasyonu (IVM)

Tubal oositler, in vivo metafaz II’ye kadar bölünme evresi geçirirler. Bu nedenle IVF için kullanılacak olan folliküler oositlerin de in vitro olarak metafaz II’ye kadar olgunlaştırılması gerekir. Zira uyarılmamış folliküllerden elde edilen oositler profazın diploten aşamasındadır.

Olgunlaşmamış oositlerin uygun kültür koşullarında tam olarak geliştirilmesi işlemine IVM denir.

Oositlerin in vitro fertilizasyonu (IVF)

Açılımında da anlaşılabileceği gibi fertilizasyonun vücut dışında gerçekleşmesidir.

IVF; fertilizasyondan önce gametlerin hazırlanması, fertilizasyon ve fertilizasyon sonrası dönemi içine alır.

IVF ve alternatif bazı yöntemler sayesinde kendilerinden yararlanamayan çok sayıda oosit ve sperm hücrelerinden yararlanabilmek böylece yüksek verimli hayvanlardan normal üreme performanslarından daha fazla yararlanabilmek mümkün olmaktadır.

Yumurtalar konvensiyonel inseminasyon veya intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) ile döllenir.Bu tercih her durum için bireyseldir. Konvansiyonel inseminasyon sırasında ortalama 50 000 sperm bir yumurta ile kültüre yerleştirilir. Döllenme işleminin gerçekleşmesi için birlikte bir gece inkubasyona bırakılırlar. Bir sonraki gün döllenmeyi,ve tekrar diğer gün erken hücre bölünmesini belirlemek için yumurtalar kontrol edilir.

Embriyo Nakli

Embriyolar yumurta alımından 3,5 veya 6 gün sonra transfer edilir.

Küçük yumuşak bir katater kullanılarak uterusa yerleştirilirler.

Bu prosedür genellikle anestezi gerektirmez.

Embriyoların in vitro kültürü (IVC)

Embriyoların blastosist aşamasına ulaşana kadar  büyütülmesidir.

Blastosist aşaması daha az embriyo transfer edilmesini mümkün kılarak, çoğul doğum riskini azaltır.Kültür için CR1aa+%5CS+antibiyotik veya SOF kullanılabilir.

Alternatif uygulamalar (ME,MM,ICSI,SZI,ZD, PZD,  PGD, NT)

Mikroenjeksiyon :

 DNA içeren bir miktar solüsyonu pronükleuslardan  birinin içine mikrokapiller enjeksiyon pipetiyle verilmesidir.

Embriyo transferi, gen aktarımı, ICSI, transgenik ve kimerik hayvanların üretilmesinde ve klonlamada kullanılan bir yöntemdir.

Mikromaniplasyon:

Oosit ve spermle yapılan işlemlerin  çoğu mikromaniplasyon kavramı içine girer.

ICSI:

Intrastoplazmik Spermatozoa Enjeksiyonu

Subzonal Enjeksiyon

Zona pellusida altına spermatozoa enjeksiyonu .

ICSI’dan farklı olarak stoplazmaya girilmez ve spermatozoanın kuyruğu aktiftir

Zona Driling

Zonaya delik açılması. Bu işlem hatching aşamasını kolaylaştırmak için yapılır.

Parsial Zona Disection

Parsial olarak zonadan parça çıkarılması. Hatching aşamasını kolaylaştırır. Oositin çıkarılması için

Preimplantasyon Genetik tanı :

Blastomer biyopsisi yöntemi ile elde edilen bir yada birkaç adet blastomer üzerinde kromozomal bozukluklar belirlenebilir.

Nükleer Transfer

Klonlamada kullanılır. Bir hücre nükleusunun başka bir hücreye aktarılmasıdır.

 

Embriyo Sexing

 

Embriyonun cinsiyetin belirlenmesi olarak tanımlanır.Cinsiyet iki tür metotla belirlenir:

     Invazif

     Non-Invazif

İnvazif yöntem

Özel prop kullanılarak erken dönemdeki embriyodan biyopsi alınarak yapılır. Sığır ve koyunlarda uygulanmıştır. Yüksek derecede doğruluk sağlar.

Non-İnvazif Yöntem

Cinsiyete spesifik sadece blastosistteki 8 hücreli dönemdeki erken embryolardan tanımlanabilen H-Y antijeninin belirlenmesini içerir. Monoklonal antikorların kullanılması, daha basit uygulanması, hızlı, pahalı olmayan ve çok sayıda embriyoya uygulanabilen bir yöntemdir.

Klonlama

Tek bir organizma, hücre veya genden cinsel birleşme olmaksızın genetik olarak tıpkısının aynı döller elde edilmesidir.Memelilerde döllenmiş yumurtanın ana rahminde bölünmesi ve ayrı ayrı gelişmesi sonucu meydana gelen tek yumurta ikizleri doğal klonlardır.Rutinde özdeş üstün nitelikli hayvanların elde edilmesi,yavru elde edemediğimiz çok iyi kalitedeki hayvanları kopyalayarak tekrar yavru veren geç hayvanlar elde edilebilir.

Çok değişik türde transgenik hayvan elde edilebilir.Tedavi amacı ile klonlama ise embryonik kök hücre elde edilmesi ile hasta insanlara yardımcı olmayı amaçlar.

Önce verici hücreler hazırlanmalıdır.Beden hücresinin izolasyonu ve canlı bir hayvan oluşturmak üzere her türlü genetik bilgiye sahip olan ve protein ihtiyacını karşılamak üzere aktif olan hücrenin in vitro ortamda inaktif hale getirilmesi sağlanır.

Alıcı Yumurta Hücresinin hazırlanır.Başka bir hayvandan elde edilen yumurtanın çekirdeği yani DNA’sı uzaklaştırılır. Yumurta hücresi ovaryumlardaki folliküllerden elde edilir ve invitro maturasyona tabi tutulur. Olgunlaşma sürecini takiben metafaz II fazına gelen yumurta hücreleri DNA’yı boyayan bir kimyasal ile muamele edilir. Nükleus, çapı 15 mikro metre olan pipetle uzaklaştırılır. Bu şekilde çekirdeği çıkarılmış her bir yumurta hücresine bir adet daha önce genetik değişikliğe uğratılmış hücre transfer edilir.

Yumurta ve somatik Hücre füzyonu, aktivasyonu ve kültürü aşamaları tamamlanır.Hazırlanan yeni hücre özel füzyon medyumu içerisinde elektrofüzyon cihazına yerleştirilir ve elektrik akımı uygulanarak iki hücrenin kaynaşması sağlanır. Kaynaşan oluşumlar kalsiyum iyonofor,cytochalasin B-D veya 6-DMAP( dimetilaminopurin ) kombinasyonu ile bölünmeleri için uyarılırlar. Oluşan klonlar değişik dönemlerde hayvanlara transfer edilir. Örneğin keçi ve domuzlarda iki hücreli iken şirujikal olarak oviduklarına, sığırlarda ise blastosist döneminde operasyonsuz olarak alıcının uterusuna transfer edilir.

 

  4) GEN MANUPLASYONLARI

GEN HARİTASI

Gen haritalaması, genlerin kromozomlar üzerinde bulunduğu yerlerin (lokus) gösterilmesidir. Böylece insan genomunun anatomisi ortaya çıkarılır. Pekçok genin ve diğer genetik markerlarin birbirlerine göre bir kromozom boyunca diziliş sırasının haritalanmasıyla bir kromozomun haritasını veya tüm genom haritasını çıkarmak mümkündür. Bu haritalama, insan vücudu fonksiyonlarının bilinmesi için gereklidir. Böylece insan genetik hastalıklarının heterojenite ve segregasyon analizleri bu bilgiler ışığında yapılabilecek ve gen tedavisi gerçekleştirilebilecektir.

Sitogenetik haritalama, genetik haritalama ve fiziksel haritalama olmak üzere  temelde üç tip gen haritası vardır.

Sitogenetik haritalar, ilk olarak sitogenetik bantlama tekniklerinin oluşturulmasıyla farklı kromozomları tanımanın yanında, subkromozomal bölgelerin de ayırdedilmesiyle ortaya çıkmıştır. Bu tür haritalar düşük rezolüsyonlu (yaklasık 6Mb) olmakla birlikte genlerin ve diğer DNA dizilerinin haritalanmasında çok basit bir yöntem olan kromozom in situ hibridizasyonu için zemin hazırlamıştır. Böylece uygun koşullarda yapılan hibridizasyondan sonra elde edilen sinyal probla, tanınan DNA dizisinin bir harita lokasyonunun tanımlanması sağlanabilir. Günümüzde in situ hibridizasyon teknikleri floresan in situ hibridizasyon olarak geliştirilmiştir. Yöntem, belirli bir DNA bölgesi kullanarak tüm kromozomlar içinde eşdeğer bölgeyi bulmak şeklinde uygulanır. DNA bölgesi, radyoizotopla veya floresanla işaretlendikten sonra ısıtma ve soğutma işlemlerini takiben tek iplik haline getirilir. Boyanmamış ve lam üzerinde yayılmış metafazlara uygulanır. Hazırlanan prob, metafazda yer alan kromozomlardan kendi ile eşdeğer bölgesi ile birleşir.

1). Floresan kullanılarak geliştirilen yeni yöntemler, çok kısa sürede klonlanmış DNA dizilerinin haritalamasında kullanılmaktadır.

Sitogenetik haritalar; fenotipin, gözlemlenebilir kromozomal yeniden düzenlenmeleri ya da kromozomal eksikliklerle ilişkilendirilmesiyle oluşturulabilir. Aynı zamanda düşük resolusyonlu fiziksel haritalar olarak da  adlandırılan bu sitogenetik haritalarda çözünürlük, genellikle birkaç megabaz uzunluğundadır. Somatik hücre hibridizasyon yöntemi ile ilk gen haritalaması, timidin kinaz enzim lokusunun 17 nolu kromozom üzerinde olduğunun gösterilmesi ile gerçekleştirilmiştir

Genetik haritalama, kısaca genomun matematiksel analizi olarak bilinir ve genlerin kromozomlar üzerindeki lokalizasyonlarının bulunmasında moleküler biyolojik yöntemler ve bir dizi karmaşık istatistiksel analizleri kullanır.

 

Özellikle genetik etyolojili hastalıkların lokalizasyonlarının saptanması alanında son derece verimli bir metod olarak karşımıza çıkmaktadır. Metod en genel anlamı ile lokalizasyonu aranan gen ile  lokalizasyonu bilinen bir genetik belirleyicinin (“marker”) kuşaklar arasında birlikte kalıtılması-nın test edilmesi esasına dayanır.

Bilindiği gibi kromozomlar mayozda karşı karşıya gelerek parça değişimine uğrarlar (“crossing-over”). Bu parça değişimleri sırasın-da birbirine yakın genler sıklıkla bir arada giderler. Uzak yerleşimli genler ise bağımsız tertiplenme kuralına göre rastgele olarak bir arada gidebilirler ya da ayrılırlar. Böylelikle yavru kuşaklarda ebeveynlerde olmayan yeni yapılanmalar ortaya çıkar. Bu olaya “rekombinasyon” olayı, ortaya çıkan ürünlere de “rekom-binant” ürünler denir. Rekombinasyon kavra-mı genetik haritalama’nın kalbini oluşturur.

Gen haritalama çalışmasını yapabilmek için kuşaklar arası kalıtımı izleyebileceğimiz ailelere ihtiyaç vardır. Genetik haritalama işlemi, farklı moleküler biyolojik yöntemleri teknik olarak kullanmakla birlikte temel olarak istatistiksel bir analizdir ve tüm istatistik yöntemlerde olduğu gibi etkin bir genetik haritalama yapabilmek için hipoteze yönelik parametrelerin çok sağlam olarak belirlenmesi gerekir. Bu metod kullanılarak herhangi bir nitelik (gen, marker, hastalık gibi) haritalanmaktaysa da en geniş kullanım alanını, genetik hastalıkların haritalanması oluşturmaktadır.

 

GENETİK HARİTA ÇIKARILA BİLMESİ İÇİN

1. Haritalanacak fenotipin özellikleri iyi tanımlanmalıdır:
2. Haritalamada kullanılacak metoda karar verilmeli ve kalıtım kalıbı olabildiğince kesin olarak belirlenmelidir.

Gen haritalama metotları 2 ana gruba ayrılır

1. a)         Parametrik metodlar: Temel olarak Linkage (Bağlantı) analizleri olarak bilinir. Linkaj analizinin başarılı olabilmesi için değişmez parametrelere ihtiyaç vardır. Bunlar:

1- kalıtım kalıbı kesin olarak bilinmelidir;

2- üç kuşaklı geniş aileler tercih nedenidir

3- örnek toplama yaklaşımı kalıtım kalıbına göre olur.

Pedigri (aile ağacı) analizleri yapılmaksızın ,linkaj analizini uygulayabilmenin imkanı yoktur.

1. b)               Non-parametrik metodlar: Niteliklerin kalıtım kalıplarını belirlemek her zaman kolay değildir. Pek çok genetik nitelik çok faktörlü bir kalıtım kalıbı gösterir ve bunlar için hipotez oluşturmakta zorluklar yaşanır. Yine her zaman birkaç kuşağı bir arada bulmak ve örneklemek olanaksızdır. Bu durumda, eksiklikler göz önüne alınarak parametrelerden bağımsız olan non-parametrik metodlar çalışmaları önerilmektedir.

Bu metodların linkaj analizine göre avantajları: 1- Kalıtım kalıbının bilinmesine gerek yoktur.

Dezavantajları ise 1- Örnek sayısı çok fazla olmalıdır 2- Özellikle kontrol grubunun oluşturulmasında çok dikkatli olunmalıdır 3- Sadece bu metoda dayalı gen bulunması maliyeti çok yüksek olan çalışmalardır ve genellikle başarısızlıkla sonlan-mıştır.

3. Haritalamada kullanılacak marker’lar (genetik belirleyiciler) doğru olarak seçilmeli, mevcut gen haritaları etkin olarak kullanılmalıdır.

 

4. İstatistik değerlendirmeler metoda göre seçilmelidir: Linkaj analizi için; LOD Skor (Logaritm of Odds Ratio) analizi uygulanır.  LOD Skor: Linkaj saptanması olasılığının linkaj gözlenmemesi olasılığına oranının logaritmik değerde ifade biçimidir.

Fiziksel ya da moleküler haritalar, genomik DNAnın klonlanmış parçalarının düzenlenmesiyle oluşturulurlar ve baz çifti sayılarına göre ayarlanmışlardır. Genetik haritadan farkı burada direkt olarak DNA’yı oluşturan bazların sırası belirlenmiştir. Böylelikle genlerin fiziksel yapıları kesin olarak ortaya konabilmektedir. Haritalama projelerinin en son aşamadaki amacı olan fiziksel harita en yüksek rezolüsyona sahiptir.

Tüm dünyada binlerce bilim adamının yaklaşık 15 yıl süren çabaları sonucunda insan DNA`sının hemen hemen tamamlanmış nukleotid dizisi yani haritası ortaya çıkmıştır. Gen haritaları sayesinde bitki ve hayvan üreticileri genetik olarak iyileştirilmiş kalitede üretim yapabilirken, insan genom haritasının çıkarılması açısından bakıldığında, biyokimyasal temeli bilinmeyen genetik hastalıklara neden olan genlerin özgül bir kromozom ya da kromozom bantı üzerine haritalanması, soyağaçları üzerinde bir marker ile olan bağlantısına dayanarak bu genin izinin sürülmesi (gene tracking),  hastalığın tedavi edilmesi, insan ırklarının evrimleri ve ırkların dünya üzerinde göç yollarının çıkarılması mümkün olacaktır.

 Gen Ekspressiyonu

Kalıtsal materyalde, genetik bilgiyi taşıyan üniteler gen olarak bilinmektedir. Hücrelerde bulunan genlerin taşıdıkları bilginin, canlının yaşantısında gerekli olan moleküllere dönüşmesi gen ekspressiyonu olarak bilinmektedir. Genin ekspressiyonu, DNA baz dizilişinden başlayıp RNA’ya kopilenip protein molekülü oluşturmak üzere aminoasitleri biraraya getirme olayıdır. Genetik bilginin bu şekilde akışı şu şekilde özetlenebilir.

1. RNA molekülleri RNA polimeraz yardımıyla DNA replikasyonu sırasındaki reaksiyona benzer polimerizasyonda kalıp olarak DNA’nın bir segmentindeki baz diziliş segmentini kullanarak enzimatik olarak sentezlenir. Bu durum transkripsiyon olarak tanımlanmaktadır.
2. RNA, ökaryotlarda kimyasal modifikasyona uğramaktadır. Bu işlem prosessing olarak bilinmektedir.
3. Protein molekülleri, RNA nın baz dizilişi kullanılarak amino asitleri kodun düzenine göre biraraya getirerek sentez edilir. RNA baz dizilişine göre amino asit dizilişinin üretimi translasyon olarak bilinmektedir. Yapılan protein, gen ürünü olarak isimlendirilir.

 

İMPRİTİNG

 

Bazı genlerin ekspresyonlarının ebeveynsel kökenleri tarafından etkilenmesi ile kendini gösteren bir işlemdir.Örneğin bir çok genetik hastalıkta, sorumlu genlerin ekspresyonu genin anne yada baba kaynaklı bağlı olmasına bağlı olarak değişmektedir.Fare embriyolarıyla yapılan bir deneyde zigotun pronukleuslarından biri uzaklaştırılmış ve yerine başka bir zigottan alınan pronukleus yerleştirilerek sonuçta 2 dişi pronukleusa ve 2 erkek pronukleusa

 

Sahip zigotlar elde edilmiştir. Her iki tip zigotunda anormal bir gelişim süreci sergilediği görüldüğünden maternal ve paternal genetik kaynakların her ikisinin de, kendilerine özgü çalışma tarzlarına bağlı olarak normal bir gelişim için gerekli ve tanımlayıcı oldukları sonucuna varılmıştır.

 

Mikroenjeksiyon Ekipmanları

 

1)      Invert mikroskop (Zeiss, Axiovert 35M)

2)      Sag mikromanipu1atör (lLeitz MR-ML)

3)      Sol miki~omanipu1atör (Leiz N~-NR~)

4)      Enjeksiyon pipeti i9in tutucu (Leitz 5242)

5)      Holding pipeti için tutucu (Leitz 5242)

6)      Mlkroenjektör (Eppendorf 5242) veya 50 milik plastik enjektdr

7)      Mikrometreli hamilton enjektör (MSH2000)

8)      Oküler mikrometresi (Zeiss 434013)

9)      Yatay pipet çekici (Microp&er, Narishige Lab. PN-3)

10)    Hava yastikli masa (Newport M-VM-3660-OPT)

11)    Microforge (Cit Alcatel, 086945)

12)    Azot Tupü (Boss)

13)    Video Monitör (Sony, Pvrn-122CE (31CM))

14)    Mikroskop kamerasi (Sony, CCD)

15)    Mikroskop fotoğrafmak (Contax 167 MT)

16)    Mikroenjeksiyon ve holding pipeti (Clark elektromedical ,GC12OTF-10)

17)    Mineral yag (Sigma, 8410)

18)    Mlikroenjeksiyon lami veya petri kutusu

Mikroenjeksiyon : DNA içeren bir miktar solüsyonun tek hücreli safhadaki embriyonun pronükleus’larından birinin içine mikrokapiller enjeksiyon pipeti yardımıyla verilmesidir.

Mikroenjeksiyon sırasında, embriyoyu tutmak için mikrometreli hamilton enjektör, pipet tutucu ve embriyo tutucu (holding) pipeti gerekmektedir. Bunun için önce 250 ml’lik hamilton enjektörünün uç kısmının çapına uyacak, beyaz bir hortum bağlanır ve hortumun diğer ucu da pipet tutucusunun arka kısmına sıkıca tutturulur. Bu bağlantı işleminden sonra, pipet tutucu içine mineral yağ konulmuş petri kutusu içine daldırılır ve mikrometresi ile yağın emilmesi sağlanır. Yapımı anlatılan embriyo tutucu (holding) pipetinin arka kısmına çok ince 3-5 mm uzunluğunda hortum takılır. Sonra, pipet daha önceden hazırlanmış bulunan pipet tutucusunun ön kısmına monte edilir ve enjektör mikrometresi çalıştırılarak enjektördeki yağın çok az bir kısmi tutucu pipetin ucuna gelmeyecek şekilde verilir. Bu pipetin uç kısmı, içinde M2 medyumu bulunan petri kutusu içine daldırılır az miktarda medyum çekilir Pipetin uç kısmi yaklaşık 5-6 dakika, M2 medyumu içinde, basıncın dengelenmesi için bekletilir. Böylelikle, embriyoyu itme, çekme ve tutma işlevini yapacak düzenek, mikroenjeksiyon için hazır hale getirilmiş olur.

Hazırlıkların tamamlanmasından sonra, işlem şu şekilde gerçekleşir;

1. Hazırlanan mikroenjeksiyon lamı invert mikroskobun tablasına yerleştirilir,
2. Çekilen mikroenjeksiyon pipeti tutucusu ile beraber sağ manipülatöre monte edilir,
3. Tutucu (holding) pipet tutucusu ile sol manipülatöre monte edilir,
4. Mikro enjektör çalıştırılır, yoksa, 50 ml’lik plastik enjektör yardımıyla mikroenjeksiyon yapılabilir,
5. Bu işlem tamamlandıktan sonra düşük büyütmeli objektif (lOx5=50) medyum damlasının tabanına odaklanır. Bu odak kısmının tam ortasına gelecek şekilde, önce sol manipülatör kullanılarak tutucu (holding) pipetin uç kısmı medyum damlasına paralel gelecek şekilde damlaya daldırılır. Daha sonra, sağ manipülatör kullanılarak enjeksiyon pipeti medyum damlasının tabanı ile 5-10⁰ açı yapacak bir şekilde damlanın dibine indirilir.
6. Bu işlem1erden sonra, mikroskop 20 x DIC objektifi ile 200 büyütmeye alınarak, enjeksiyon pipetinin ucunun açıklığı kontrol edilir, aktarılacak DNA solüsyonunun damla hacmi mikro enjektörün P2 basınç düğmesiyle ayarlanır.

7. Yukarıda anlatılan ön hazırlıklar tamamlandıktan sonra, zigotlara mikroenjeksiyon işlemine başlanır. Önce tutucu pipet embriyolardan birisine yaklaştırılır ve herhangi bir tanesi yakalanarak tutulur. Daha sonra, hamilton enjektörün mikrometresi kullanılarak embriyo itilip çekilir ve böylece pronükleuslar daha belirgin bir hale getirilir. Bu esnada, zona pellusidanin tutucu pipete doğru çeki1diği görülür, ayrıca erkek pronükleus (erkek pronükleus, II. Polar cisimcikten uzak Ve dişi pronükleusdan daha büyük olanıdır) enjeksiyon pipetinin uç kısmına yakın olacak şeki1de holding pipetiyle tutulur (pronüikleus tutucu pipetin merkez eksenine olabildiğince yakın olacak biçimde tutulmalıdır)

8. Embriyo bu şekilde tutulduktan sonra, Önce erkek pronük1eus mikroskopta fokuslanarak netleştirilir ve daha sonra, enjeksiyon pipetinin uç kısmı erkek pronükleusun görüntüsü ile ayni fokusta olana dek sağ manipülatörün ince ayar düğmesi vasıtasıyla ayar yapılır. Her ikisi net bir şeki1de görünür hale geldiği zaman, enjeksiyon pipeti çok hızlı bir şeki1de zona pellusida’dan geçirilerek erkek pronukleusa doğru girilir. Nükleolilerin üst bö1gesine yaklaşık olarak 1-2 pl (piko litre) DNA solüsyonu verilir. Pronükleusun normalinden iki kat daha fazla büyüdüğü görüldüğü anda, enjeksiyon pipeti çok hızlı bir şekilde dışarı çekilir. Özellikle, enjeksiyon pipetinin Uç kısminin pronükleusun içinde bulunan nükleolilere değmemesine dikkat edilmelidir,

9.Yaklaşık 15-20 adet embriyo grupları oluşturularak her bir embriyoya mikroenjeksiyon yapılır ve enjeksiyon yapılan embriyolar medyum damlasının bir bölgesinde biriktirilir (örneğin, enjeksiyon yapılmış embriyolar üstte, yapılmamışlar altta gibi). Böylece, mikroenjeksiyon yapılanlarla yapılmayanlar birbirleriyle karıştırılmazlar.

10. Mikroenjeksiyon bitiminden sonra, enjeksiyon lamı invert mikroskoptan alınır ve stereo mikroskop altına alınarak, burada sağlam kalan ernbriyolar (normal büyüklük ve daire şeklinde, zona pellusidalari düzgün, sitoplazmaları berrak ye pronükleuslari daği1mamiş olan embriyolar) pipetle toplanarak daha önceden etüve konmuş olan ve enjeksiyon yapıldığına dair bir işaretle işaret1enmiş petri kutusu içerisindeki medyuma aktarılır ve transfer edilinceye kadar 37⁰C’Iik etüvde bekletilir.

11.Yukarıda anlatıldığı gibi, her bir 15-20 adet embriyoluk grup için,yeni bir enjeksiyon preparati hazırlanarak, sonraki mikroenjeksiyon işlemleri aynen uygulanır.

İndüklenebilir Gen Hedeflenmesi

Herhangibi bir maddenin uygulanması gibi deneysel bir manipulasyon yolu ile hedef genin indüklenebilir nitelikte bir inaktivasyonu yada aktivasyonuna  olanak tanıyan bir yöntemdir.

Cre rekombinaz enzimi bölge spesifiktir ve belirli diziler tarafından kuşatıla bir DNA parçasının kesilip çıkartılmasını katalize eder. Bu enzimi kodlayan genin promoter bölgesinin interferona duyarlı olduğunun saptanmasından bu yana hedeflenmiş delesyonlar indüklenebilmektedir.

 

Kök Hücreler

İnsan vücudunda farklı hücre tiplerine dönüşebilme ve kendisini yenileyebilme gücüne sahip hücrelere “Kök Hücre” denmektedir. Kök hücre çalışmaları 1998’de insan embriyosundan kök hücrelerin elde edilip kültürlerde çoğaltılmasından sonra hız kazanmıştır. Bu hücreler kontrol edilebildiği taktirde laboratuvar ortamında istenilen hücre türüne dönüştürülebilmektedir .

Sperm ile oositin fertilizasyonu sonrası tek başına tüm organizmayı meydana getirebilecek genetik bilgiye sahip olan “Zigot” meydana gelir. Vücuttaki tüm hücrelere dönüşebilecek potansiyele sahip olan bu ilk embriyonal hücreye “Totipotent Hücre” denir. Fertilizasyonu izleyen ilk 4-5 gün içerisinde tek hücreden meydana gelen tüm hücreler aynı güce sahiptir yani ilk 4 gün içerisinde oluşan hücreler uterusa yerleştirildiğinde her biri tek başına bir organizma, yani insan oluşturabilecek güçtedir. Beşinci günden sonra meydana gelen hücreler “Blastosit” denilen küresel bir şekil alırlar. Bu hücre kümesinden alınan hücrelerin her birine “Embriyonik Kök Hücre” denmektedir. Bu küre içerisindeki hücreler vücuttaki tüm hücrelere dönüşebilecek potansiyele sahiptirler ancak tek başlarına tüm organizmayı oluşturamazlar. Gerekli ortam sağlandığında bu hücreler bilinen yaklaşık 200 hücre türüne dönüşebilmektedirler. Bu nedenle bu hücrelere “Plüripotent Hücre” de denmektedir . Embriyonun daha ileri gelişim aşamalarında ise hücreler biraz daha özelleşerek erişkin kök hücrelerine dönüşmektedir. Bu hücrelere de “Multipotent veya Progenitör Hücre” denmektedir. İnsan vücudunda ancak belirli birkaç hücre türüne dönüşebilen erişkin kök hücreleri, laboratuvar koşullarında gerekli ortam ve sinyaller sağlandığında çok daha fazla hücre türüne dönüşebilmektedir

1) İnsan veya hayvan embriyosundan elde edilen ≤embriyonik kök hücreler≤
2) Embriyoda daha ileride sperm veya oositi meydana getirecek üreme hücreleri olan, embriyonun genital bölgesinden elde edilen ≤embriyonik jerm hücreleri≤
3) Erişkinlerde bulunan ≤erişkin kök hücreler ≤

Embriyonik Kök Hücre Çalışmaları

İlk olarak evans ve kaufman  (1981) ve martin (1981) tarafından farelerden elde edilmiştir. Kısa süre sonra bu hücrelerin embriyoya ve daha sonra embriyoların alıcılara transfer edilmesi ile ilk kimerik hayvanlar elde edilmiştir ve bu bu hücrelerin kimerada değişik dokulara girdiği ve üreme hücrelerini dahi oluşturduğunu gösterilmiştir. EK hücrelerinin genetik maniplasyonu ile ilgili ilk çalışma robertson ve ark (1986) tarafından yapılmıştır. Bu güne kadar 100den fazla gende homolog rekombinasyon ile EK hücrelerinde modifikasyon yapılmış ve döllerle aktarılmıştır.

Bir noktadan sonra klonlama ve kök hücre teknolojisinin bir araya geldiğini görüyoruz. Farelerden kök hücre elde edilmesinin ardından aynı şekilde çiftlik hayvanlarından da kök hücre elde edilmeye başlanıldı. Böylece 1996 yılında ilk kez koyun EK  hücreleri nüklear transferde kullanılarak klon koyun elde edildi.bu çalışma ile ilk olarak kültürdeki hücreler kullanılarak klonlama gerçekleştirilmiş oldu. Teknolojideki bu ilerlemeler daha hızlı sayıda klon canlı oluşturulabilmesini sağlayacaktı. Bunu takiben diğer memelilerde de klonlamada kullanılmak üzeri ESC elde edilmesi üzerine çalışmalar başlatıldı.1997’de 6 yaşındaki bir koyunun meme hücresi kullanılarak bir klon kuzunun elde edilmesi klonlamanın tarihinde bir dönüm noktası oldu. Bu tarihten itibaren sığır, keçi, koyun, domuz aynı yöntemle klonlandı. Ancak asıl önemli olan , invitro ortamda genetik değişikliğe uğratılmış fetalfibroblast hücrelerin nükleer transferi ile transgenik hayvanların üretilmesidir. İlk transgenik klon buzağılar 1998 yılında elde edilmiştir. Takip eden yıllarda yine bu teknoloji ile transgenik koyun , keçi, domuz elde edilmiştir.

Bugüne kadar in vitro ortamda genetik olarak değiştirilmiş fetal fibroblast hücreleri kullanılarak klon hayvanlar üretilmiş olmasına rağmen erişkin hayvan hücrelerinde aynı şekilde in vitro ortamda genetik olarak manipule edilebildiği ve bu hücrelerin transgenik embriyoları ürettiği gösterildi. Vücut hücrelerinin klonlamada kullanılmaya başlanması ile birlikte klonlama teknolojisi ve kök hücre teknolojisi tekrar birbirinden ayrı noktalara gitmeye başlamıştır.

KİMERİK HAYVANLAR

KİMERA: iki veya daha fazla sayıda farklı genotipteki organizmaya ait hücrelerin bir arada bulunduğu tek bir organizmadır.Memeli kimeraları en az iki farklı embriyodan elde edjlen blastomerlerin bir araya getirilmesiyle oluşturulan hayvanlar. Bu hayvanların dokuları her bir embriyodan gelen hücrelerden oluşmuş mozaik bir yapıya sahiptir. Her bir embriyodan gelen hücrelerin oranı kimeralar arasında veya bir kimeranın değişik dokuları arasında farklılık gösterir.

KİMERİK FARE ÜRETİMİNDE KULLANILAN YÖNTEMLER

Temel olarak, kimeralar ya embriyolar arasında veya EK hücreler ile embriyolar arasında gerçekleştirilen agregasyonla ya da morula veya blastosist aşamasındaki embriyolara EK hücrelerin enjekte edilmesi ile üretilirler. Kimerik hayvanların üretimi ile ilgili yöntemler aşağıda kısaca açıklanmıştır.

 

1. Agregasyon kimeralan

a.i) Embriyolarda zona pellusidanm uzaklaştırılması

Zona pellusida embriyoların ya asidik tirod solüsyonunda veya proteolitik etkili pronaz gibi bir enzim içeren medyum içerisinde tutulması ile kolayca uzaklaştınlabilir

 

METOT:

1. 35 mm’lik petri kutusuna yaklaşık 1 mi asid tirod solüsyonu (oda ısısında) konur. Mümkün olduğu kadar küçük bir hacim (birkaç mikrolitre gibi) içinde embriyolar tirod solüsyonuna transfer edilir.
2. Stereo mikroskop altında embriyolar kontrol edilir ve zonalar kaybolur kaybolmaz, petri kutusu M2 medyumu ile doldurulur veya embriyolar içinde M2 medyumu olan başka bir petri kutusuna aktarılır.

a.ii) Morula-morula agregasyonu

METOT:

İki farklı yöntemle gerçekleştirilebilir.

♦   Mikrodamla kültür setinde agregasyon

Daha önce anlatıldığı gibi embriyoların zonaları asidik tirod solüsyonunda uzaklaştırılır.Embriyolar çiftler halinde mikro-damla kültürdeki her bir damlaya (5-10 µl) yerleştirilir ve birbirlerine temas halinde bırakılırlar İşlemde ikiden fazla embriyo da kullanılabilir.Bu şekilde embriyoların yerleştirildiği kültür kabı inkübatöre yerleştirilir.Ertesi gün her damlada tek bir blastosistin görülmesi her iki embriyonun birleşerek kimerik blastosisti oluşturduğunun delilidir.

Gelişen blastositler 2.5 günlük yalancı gebe farenin uterusuna transfer edilir.

 

♦   Asılı damla kültür setinde agregasyon

1. içinde M2 medyumu bulunan petri kutusunun kapağınm iç yüzüne küçük M2 ya da kültür medyumlarından damlalar yerleştirilir.
2. Her bir damlaya bir öncekinde anlatıldığı gibi embriyo çiftleri yerleştirilir.
3. Kapak ters çevrilerek petri kutusunun üzerine kapatılır ve inkübatöre kaldırılır.
4. Ertesi gün blastosist aşamasına gelen embriyolar 2.5günlük alıcinın uterusuna-transfer edilir.

a.iii) Morula-embriyonik kök (EK) hücre agregasyonu

METOT:

İki farklı yöntemle gerçekleştirilebilir.

♦    Mikrodamla kültür setinde agregasyon

1.       10-15 hücre içeren EK hücre kümeleri hazırlanır.
2. Toplama pipeti ile her kültür damlasına bir embriyo ve bir hücre kümesi yerleştirilir.
3. Embriyo ve kök hücreler temas halinde bırakılır ve petri kutusu inkübatöre kaldırılır.
4. Ertesi gün blastosist aşamasına gelen embriyolar 2.5 günlük alıcının uterusuna transfer edilir.

♦    Asılı damla kültür setinde agregasyon

1. Daha önce anlatıldığı gibi, hazırlanan asılı damlalar içerisine EK hücre kümesi ve morula
   yerleştirilir. Petri kutusu inkübatöre kaldırılır.
2. Ertesi gün blastosist aşamasındaki embriyolar alıcıların uteruslanna transfer edilir.

 

1. Enjeksiyon kimeraian

b.i) Enjeksiyon ve tutucu pipetin hazırlanması

METOT:

1. Tutucu pipet DNA enjeksiyonundaki gibi hazırlanır.
2. Enjeksiyon pipetinin hazırlanması için pipet, pipet çekiciye yerleştirilir ve magnet ayan ince çekim için ayarlanır.
3. Mikroforjun ısıtıcı flamenti üzerinde bir cam damlası oluşturulur. Flament ısıtılır ve pipet ucu 12-15 micronmlik iç çapa sahip bölgesinden ısınmış cam damlasına değdirilerek kırılır.
4. Pipet daha sonra mikrogrinder’a yerleştirilir ve ucu dönen bileyici taşa değdirilerek traşlanır.
5. Pipet tekrar mikrofona yerleştirilir ve pipetin ucu ısıtılmış cam damlasma hafif değdirilip yukanya çekilerek sivriltilir.

2.b.ii) Enjeksiyon setinin hazırlanması

METOT:

1. Sol tarafta bulunan mikrometreli hamilton enjektör ve ona bağlı ince tüp içine mineral yağ doldurulur. Sistemin içinde hava kabarcığı olmamasına dikkat edilir.
2. Aynı taraftaki maniputatörün tutucusuna tutucu pipet yerleştirilir ve mineral yağı hamilton şırınga ile pipetin ucuna doğru gönderilir. Ucuna yakın bir yerde dolum işlemi durdurulur.
3. Tutucu pipetin ucu içinde M2 medyumu bulunan petri kabına daldırılır ve bir miktarmedyum pipetin içine çekilir. Böylece pipet içerisinde, mineral yağı ve M2 medyumu arasında bir hava kabarcığı kalmış olur.
4. Enjeksiyon pipeti sağ taraftaki mikromanipulatörün tutucusuna yerleştirilir ve hamilton şırınga ile pipetin içine mineral yağının dolması sağlanır

2.b.iii) EK hücrelerinin morulaya enjeksiyonu

 

METOT:

1. Deney günü sabahleyin 2.5 günlük gebe hayvanlardan ovidukt yıkaması ile morulalar elde edilir.
2. EK hücreler morula enjeksiyonu için hazırlanır. Tripsinleme yapılmadan 1 saat önce EK hücreler taze medyum ile beslenir. Daha sonra, tripsinlenerek tek hücre süspansiyonu haline getirilir ve hepesli DMEM medyumunda + 4 °C’de tutulur. Bu süspansiyon gün boyuncakullanılabilir.
3. Enjeksiyon kabına (100 mm petri kutusu «veya enjeksiyon lamı) otomatik pipet ile 100-150 u.1 ‘lik M2 medyum damlası yerleştirilir. Damlarım üzeri mineral yağı ile kaplanır.
4. Çapı 30 um olan transfer pipeti ile hücre süspansiyonundan EK hücreler çekilir vedamlarım tabanına yaydır.
5. Morulalar enjeksiyon kabına yerleştirilir.
6. Tutucu ve enjeksiyon pipetleri damla içine daldırılır ve hücreler ile aynı düzeye getirilir.
7. Enjeksiyon pipetine zemindeki EK hücreler çekilerek, enjeksiyon pipeti içerisine alınır. EK hücreler ile fibroblast hücreleri karışık olarak bulunduğundan toplama esnasındaseçim önemlidir. Fibroblast hücreleri kök hücrelerden yaklaşık 3 kat daha büyük ve düzgün olmayan hücre sınırlarına sahiptir. Küçük, düzgün sınırlı, yuvarlak ve parlak görünümlü EK hücreler enjeksiyon için seçilmelidir.
8. Tutucu pipet ile bir morula yakalanır. Enjeksiyon pipeti ile, blastomerlere zararvermeden, zona delinir ve bu delikten enjeksiyon pipeti embriyo içerisine sokulur. Daha sonra, zonanın altına 5-8 adet hücre bırakılır ve pipet yavaşça dışarı çekilir.
9. Enjeksiyon yapılan tüm morulalar mikro-damla kültür setine yerleştirilir ve gece boyu inkübatörde kültüre edilir.
10. Ertesi gün blastosist dönemine gelen embriyolar 2.5 günlük alıcının uterusuna transfer edilir.

b.iv) EK hücrelerinin blastosiste enjeksiyonu

 

METOT:

1. Deney gününde  sabahleyin   3.5   günlük  gebe  hayvanlardan   uterus   yıkaması   ile blastosistler elde edilir
2. Tripsinleme yapılmadan 1 saat önce EK hücreler taze medyum ile beslenir. Daha sonra, tripsinlenerek tek hücre süspansiyonu haline getirilir ve hepesli DMEM medyumunda +4 “C’de tutulur. Bu süspansiyon gün boyunca kullanılabilir.
3. Enjeksiyonjcabına (100 mm petri kabı veya enjeksiyon lamı) otomatik pipet ile 100-150 uTlik M2 medyum damlası yerleştirilir. Damlanın üzeri mineral yağı ile kaplanır.
4. Çapı 30 [im olan transfer pipeti ile hücre süspansiyonundan EK hücreler çekilir ve damlanın tabanına yayılır.
5. Blastosistler damla içine bırakılır.
6. Tutucu ve enjeksiyon pipetleri damla içine daldırılır ve hücreler ile aynı düzeye getirilir.
7. Enjeksiyon pipeti ile zemindeki EK hücreler toplanır. EK hücreler ile fibroblast hücreleri   karışık   olarak   bulunduğundan,   toplama   esnasındaki seçim önemlidir. Fibroblast hücreleri kök hücrelerden yaklaşık 3 kat daha büyük ve düzgün olmayan hücre sınırlarına sahiptir. Küçük, düzgün sınırlı, yuvarlak ve parlak görünümlü EK hücreler enjeksiyon için seçilir.
8. Tutucu pipet ile bir blastosist yakalanır. Blastosistin iç hücre yığını tutucu pipet ucunun onune, yukarısına veya alt tarafına gelmelidir.
9. Enjeksiyon pipeti trofektoderm hücrelerinin arasından blastosöl boşluğuna doğru sokulur ve 10-15 hücre bırakılır. Pipet yavaşça dışarı çekilir ve aynı işlem diğer blastosistlerde de uygulanır.
10. Enjeksiyon sonrası blastosistlerde kollaps meydana gelir. Bu nedenle, enjeksiyon sonrasından 2-3 saat kadar embriyolar inkübatörde bekletilir ve blastosöl boşluğunun yeniden şekillendiği gözlenir.
11. Embriyolar 2.5 günlük alıcının uterusuna transfer edilir.

 

KİMERİZMİN BELİRLENMESİ

EK hücrelerin embriyoya transferinden sonra doğan yavrularda kimerizmin varlığı ve derecesi genellikle tuy rengine göre belirlenir. EK hücre hatları genelde pigmentli fare soylarının embriyolarından elde ediIir,Bu hücrelerin transfer edildiği embriyolar ise siyah renkli fare soyu (CDTBL) veya albino bir soydur. Bu nedenle doğan kimerik hayvanlarda ıkı renklilik görülür. Bu ıkı renklilik kimerizmin delili sayılır. Tüydeki renk oranı kimerizmin oranını da kabaca yansıtır ve genelde kimerik hayvanda % 50-60 pigmentli deri EK hücrelerin bu oranda eşey  hattına  girdiğinin de bir işareti sayılır. Eğer pigmentli bölge oranı %5-10 kadar az ise , EK hücrelerinin eşey hattına girmiş olma şansı düşüktür.   Kimerada üreme hücreleri (sperm veya ovum) bazen tek hücre grubundan bazen her iki hücre grubundan gelişebilir. Dişi embriyo ile kombinasyonda seks dönüşümü, EK hücrelerin dolayısıyla genetik değişikliğin yavrulara aktarımında avantaj sağlar. Çünkü fenotipik erkek kimerada XX hücreler sperm üretemez ve böylece spermler sadece EK hücre kaynaklıdır. Bazı laboratuarlarda, EK hücrelerin üreme hücrelerinin ürettiği fenotipik fertil dişi kimeralar elde edildiği bildirilmiştir.

 

Transgenik Hayvan Üretiminde Kullanılan Teknikler

 (Mikroenjeksiyon, embriyonik kök hücre teknolojisi ve nükleer transfer)

 ve Transgenik Hayvanların Kullanım Alanları

Transgenik hayvanlar, genomlarında kendilerine ait olmayan bir geni taşıyan hayvanlar olarak tanımlanır yaşam bilimleri içinde geniş bir uygulama alanı bulmuşlardır. Transgenik hayvan üretmek için gen transferi uygulamaları 1980 yılında ilk defa farelerde gerçekleştirilmiştir. Bu transgenik fareler moleküler düzeydeki temel araştırmalarda kompleks biyolojik işlemleri aydınlatmada güçlü araçlar olduklarını kanıtlamışlardır.

Transgenik hayvanlar rekombinant DNA teknolojisinin kullanılmasıyla üretilirler ve genellikle iki yada daha fazla farklı genin elementlerini içerirler. Transgen bir genin düzenleyici elementlerini (enhancer element ve promotor) ve hedef genin protein üreten DNA baz sırasını içerebilir. Düzenleyici elementler hedef genin istenilen gelişme döneminde ve istenilen dokuda ekspressiyonunu sağlayan bölgelerdir. Gen transferinin yöntemine bağlı olarak transgen aynı zamanda bu elementlere ilave olarak ekspressiyonu ve gen transferinin başarısını tespit edebilmek için bazı işaretleyici (marker) genleride içerebilir. Transgen hedeflenen amaca göre çeşitli şekillerde dizayn edilirken yine hedeflenen amaç doğrultusunda gen transferinin yöntemi ve gen transferinin yapılacağı hayvan seçilir.

 

GEN TRANSFERİ YÖNTEMLERİ

 

1. Pronükleer gen enjeksiyonu:

Bu yöntem çoğunlukla fare gibi küçük laboratuvar hayvanlarında yaygın olarak kullanılır. Çiftlik hayvanları gibi ekonomik değeri olan hayvanlarda başarı oranı düşük bu yüzden bu tür hayvanlarda kullanılmazlar.Bu yöntemde ilk önce transfer edilmek istenen gen uygun şekilde dizayn edilir. Hedef gen o hayvana ait olabilir veya başka bir hayvana yada insana ait olabilir. Hedef genin ekspressiyonu için hangi dokuda ekpresse ettirilmek isteniyorsa o dokuya özel düzenleyici bölgeler transgene ilave edilir. Dizayn edilen transgen tek hücreli embriyonun bir pronukleusuna enjekte edilir. Bunun sonucunda rasgele bir integrasyon oluşur ve transgen herhangi bir kromozomun herhangi bir bölgesine yerleşir. Ancak seçilmiş olan promotor ile istenen dokuda ekspresse olur.

Pronükleer enjeksiyonun basamakları

1. A)      Verici hayvanların süperovulasyonu

Süperovulasyonu oluşturmak için ovule olan yumurtaların sayısını artırmak amacıyla çiftleşmeden önce gonadotropinler uygulanır. Bunun için folikülleri geliştirmek amacıyla FSH (PMSG)etkili bir hormon ve daha sonrada ovulasyonu sağlamak için LH (HCG) etkili bir hormon uygulanır. HCG enjeksiyonunu takiben fareler çiftleştirilir.Farelerde bu şekilde hayvan başına 20-30 embriyo elde edilebilir.

1. B)      Alıcı hayvanların hazırlanması

Alıcı fareler gen transferi uygulamasından sonra embriyoların transfer edildikleri yalancı gebe farelerdir.

1. C)     Tek hücreli embriyoların eldesi ve DNA’nın enjeksiyonu

Fertilize olmuş yumurtalar mikroenjeksiyondan birkaç saat önce toplanabilir. Elde etme işlemi tahmini fertilizasyondan 10-11 saat sonra yapılır. Bunun için verici fare servikal dislokasyon ile öldürülür ve karın duvarı kesilerek genital organlara ulaşılır. Tek hücreli embriyoların içinde bulunduğu ovidukt dışarı alınır ve ampulla kesilerek embriyoların dışarı çıkması sağlanır.

 

1. D)     DNA’nın enjeksiyonu

Elde edilen yumurtaların döllenmiş olup olmadığı mikroskop altında incelenir. İki polar cisimciğe sahip olan döllenmiş yumurta hücreleri (zigot) enjeksiyon için seçilir. Yine mikroskop altında herbir zigotun erkek pronukleusuna 1 mm uç çapına sahip ve içine 2mg/ml konsantrasyonda DNA doldurulmuş mikroenjeksiyon pipeti ile 2 pikolit DNA enjekte edilir. Miktar pronukleusun enjeksiyon sonrası 2 kat büyüdüğünün görülmesi ile belirlenir.

1. E)      Embriyoların alıcılara transferi ve transgenik kontroller

Enjeksiyonu takiben canlı kalan zigotlar anestezi altındaki alıcı farelerin oviduktuna hayvan başına 15-30 arasında transfer edilir Transferleri takiben gebelik süresi 19-21 gündür. Doğumdan sonra en erken 14 günde yavruların kuyruk dokuları alınır ve genomik DNA izole edilir. İlk olarak transgen için dizayn edilen primerler kullanılarak PCR ile hayvanın tarangenik olup olmadığı kontrol edilir ve transgenik çıkanlar souther blot yöntemi ile teyit edilir.

 

2. Embriyonik kök (EK) hücre teknolojisi

EK hücrelerin genetik manipulasyonu ile ilgili ilk çalışma Robertson ve arkadaşları (1986) tarafından yapılmıştır. Bugüne kadar 100 den fazla gende homolog rekombinasyon ile modifikasyon yapılmış ve döllere aktartılmıştır. Fare embriyonik kök hücreleri blastosist dönemindeki fare embriyolarının iç hücre yığınından (inner cell mass) elde edilir. Pluripotent yani her dokuya dönüşme özelliği olan bu hücrelerin pluripotensisi medyuma farklılaşmayı önlemek için lösemi inbitör faktör (LIF) katılarak ve mitotik olarak inaktive edilmiş fibroblast hücreleri ile birlikte kültüre edilerek muhafaza edilebilir. Bu hücreler embriyonal çevreye transfer edildiklerinde normal gelişimlerini sürdürür ve eşey hattı da dahil olmak üzere tüm dokuların oluşumuna iştirak ederek kimerik bir hayvanın şekillenmesine sebep olurlar. In vitroda  genetik olarak modifiye edilebilir ve mutant farelerin üretilmesini sağlarlar. Bu sistemin avantajlarından biri genetik manipulasyon sonuçlarının hücreler embriyoya verilmeden önce in vitro da gerek farklılaşmamış hücrelerde gerekse farklılaşma esnasında izlenebilmesidir. Bu hücrelerin embriyoya verilmesi ise sonuçların in vitro olarak değerlendirilmesini sağlar. Önemli bir diğer avantajı istenen genin hedeflenmesi ile homolog rekombinasyonun şekillendirilmesidir. Böylece farenin kendi geni ile onun homologu olan başka bir genin yer değiştirmesi sağlanarak mutant fareler geliştirilebilir.  Bu mutant hayvan modelleri in vivo olarak karışık gelişim sisteminde hedef genlerin fonksiyonlarının çalışılmasına imkan sağladığı gibi gen mutasyonlarına bağlı genetik insan hastalıklarının modelleri olarak da hastalığın teşhis ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için kullanılırlar.

 

Embriyonik kök hücre teknolojisinin basamakları

1. A)      Embriyonik kök hücrelerin eldesi ve kültürü

Yeni bir hat elde etmek için blastosist dönemindeki embriyolar mitotik olarak inaktive edilmiş fare embriyonik fibroblast hücreleri ile kaplanmış kültür kabında ve LIF ilave edilmiş kültür medyumunda kültüre edilir. Bir müddet sonra trofoblast hücrelerinin farklılaşıp yayıldığı ve bir grup hücrenin yuvarlak koloniler şeklinde çoğaldığı görülür. Bu koloniler alınarak aynı şekilde hazırlanmış taze kültür kaplarına aktarılarak çoğaltılır.

1. B)      Kök hücrelere gen transferi

Koloni şeklinde büyüyen hücreler enzim yardımıyla birbirinden ayrılarak tek hücre süspansiyonu elde edilir. Bu hücrelere genellikle elektroporasyon ile gen aktarımı yapılır. Yaklaşık 20-40 mg DNA verilir. Gen hedefleme vektörü; hedef geni ve marker genleri içerir. Marker genlerden biri pozitif seçim için (örn. neomisin dirençlilik geni) diğeri negatif seçim için ( örn. Herpes simpleks trimidine kinaz geniö HSVtk) kullanılır. Elektroporasyon sonrası hücreler yüksek dozda genetisine maruz bırakılır. Eğer hücreler neo genini taşıyorsa ölmezler ve böylece hangi hücrelerin transgenik olduğu belirlenir. Negatif seçim ise yüksek dozda gansiklovir uygulamasında eğer  hücre HSVtk genini  taşıyorsa hedef gen istenen yere girmemistir rastgele bir bölgeye yerleşmiştir. Böylece bu hücreler ölür ve geriye hedef geni istenen yerde taşıyan hücreler kalır.

 

1. C)     Kök hücrelerin embriyoya transferi

Pozitif cevap sonucu belirlenen transgenik kök hücreler kendi başlarına bir embriyoyu oluşturamayacakları için başka bir ev sahibi embriyoya transfer edilirler. Bu embriyolar morula veya blastosist dönemindeki embriyolar olabilir. Blastosist dönemindeki embriyolar 3.5 günlük verici farenin uterusunun yıkanması, morula dönemindeki embiyolar ise 2.5 günlük verici farenin oviduktunun yıkanması ile elde edilir. 5-10 adet EK hücre ya morulanın zona pellusidası altına veya blastosistin blastosol boşluğuna enjeksiyon pipeti ile transfer edilir.

1. D) Embriyoların alıcı farelere transferi

EK hücrelerin transfer edildiği morulalar gece boyu kültür sonrası, blastosistler ise yarım saat sonra 2.5 günlük alıcı yalancı gebe farelerin uterusuna transfer edilir. Embriyo transferinden 17-18 gün sonra yavrular doğar. Doğan yavrular iki farklı hücre grubundan oluşmuş kimera olarak isimlendirilen hayvanlardır.

1. D)     Kimerik fareler ve EK hücrelerin döllere aktarımı

Bu hayvanların dokuları her iki embriyodan gelen hücrelerden oluşmuş mozayik bir yapıya sahiptir. Her iki hücre grubunun oranı kimeralar arasında veya bir kimeranın dokuları arasında farklılık gösterir. Kimerizmin görülür olabilmesi için EK hücre hatları pigmentli bir fare soyundan hazırlanır. Ev sahibi embriyo olarak ise albino bir soyun embriyosu kullanılır. Böylece doğan kimeraların tüy rengi pigmentli ve albino lekeler halindedir. EK hücreler XY kromozom taşıyan yanı erkek hücre hatlarıdır. Bu embriyolar dişi embriyoya transfer edildiklerinde %90 oranında bir seks dönüşümüne sebep olur ve fenotipik fertil erkek fare oluşumuyla sonuçlanır. Kimerik farede üreme hücrelerini ya sadece tek bir hücre grubu veya her iki hücre grubu üretebilir. Bu durumda kimerik fare albino bir fare ile çiftleştirildiğinde hem beyaz hem pigmentli yavru verebilir. Pigmentli yavrular üreme hücrelerinin EK hücreler tarafından meydana getirildiğini gösterir. Böylece transgende döllere aktarılmış olur.

3. Nükleer transfer (klonlama)

Üremenin aseksüel formu olan klonlama aynı genetic yapıya sahip yanı birbirinin aynısı canlıların oluşturulması anlamına gelmektedir

 

Nükleer transfer ile transgenik klonların eldesi

1. A)      Verici hücrelerin hazırlanması ve gen transferi
2. B)      Alıcı yumurta hücresinin hazırlanması ve nükleer transfer
3. C)     Yumurta ve somatik hücre çiftlerinin füzyonu, aktivasyonu ve kültürü

TRANSGENİK HAYVANLARIN UYGULAMA ALANLARI

İnsan hastalıklarının transgenik hayvan modelleri

Bu hayvanlar genetik insan hastalıkları için oluşturulmuş modellerdir ve bu modeller hastalığın karışık moleküler mekanızmasının aydınlatılması, yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için üzerinde çalışılabilecek hasta modelleridir.

Sütünde insan proteinleri üreten transgenik çiftlik hayvanları

İnsan hastalıklarının tedavisinde kullanılan insan proteinlerinin elde edilmesi güç ve pahalıdır. Transgenik çiftlik hayvanları bu proteinlerin bol miktarda üreten güvenli kaynaklardır. Hemofili gibi birçok insan hastalığı proteinlerin üretimindeki yetersizlik sonucu oluşmaktadır. Bu hastalıkların tedavisi için eksik olan bu proteinlerin hastalara verilmesi gerekir. Bu şekilde çeşitli pıhtılaşma faktörler (anti-thrombin-III, Fctor VIII,  Factor IX ) bu tip hastalıkların tedavisinde kullanılmak üzere koyun ve keçilerin sütünde üretilmektedir.

 

Organ veya hücre transferinde kullanılmak üzere üretilen transgenik domuzlar

Biyolojik ve fizyolojik olarak insana yakınlığı ve organ büyüklüğünün uygunluğu dolayısıyla domuz organ transplantasyonunda en iyi aday hayvan olarak görülmektedir.

Çiftlik hayvanlarında verim özelliklerinin iyileştirilmesi için yapılan değişiklikler

Çiflik hayvanlarının süt kompozisyonunun (anne sütüne yakın süt, laktozsuz süt) değiştirilmesi ve daha yararlı ve sindirimi daha kolay süt üretmek için çalışmalar yapılmaktadır. Veya koyunlarda yapağı kalitesini arttırmak, kollesterolu düşük ete sahip sığırların oluşturulması gibi verim özelliklerini iyileştirmeye yönelik çalışmalar sürmektedir.

Hastalıklara dirençli hayvanların oluşturulması

Bir diğer çalışmada hastalıklara dirençli transgenik çiftlik hayvanlarının oluşturulmasına yöneliktir. Özellikle somatik hücrelerde genin hedeflenebilmesi ve fonksiyonunun ortadan kaldırılabilmesi bazı hastalıklardan sorumlu olduğu düşünülen proteinlerin hedef alınmasına sebep olmuştur.

 

Biofarming

 

Biomedikal proeinlerin yada oldukça büyük tibbi öneme sahip bazı terapötik maddelerin yüksek miktarda üretilmesi amacıyla bu proteinleri kodlayan genleri taşıyan transjenik hayvanların geliştirilmesidir.

Genellikle çiftlik hayvanlarında kullanılmaktadır.

Transgenlerin ekspresyonları, en bol miktarda üretebilecekleri dokulara yönlendirilmekte ve çoğunlukla süt yada idrara salgılanmaları sağlanmaktadır.

Daha sonra ise toplana bu sıvılardan hedef proteinlerin saflaştırılması yoluna gidilmektedir.

Bioreaktör Hayvanlar

Bioreaktör uygulamalarının ilk örneği 1990 yılında doğan Tracy isimli koyundur.

Tracy’i diğer koyunlardan ayıran özellik sütünde alpha – 1 – antitrypsin (AAT)adı verilen enzimin salgılanmasıydı.

Bu enzim normalde insan kan plazmasından elde ediliyordu ve bazı akciğer hastalıklarının tedavisinde kullanılıyordu

Bu metot hem pahalı hemde hastalık taşıma riskine sahipti.

Wilmut ve Campbell, AAT enziminin genetik kodunu Tracy’ye aktardılar.

Tracy büyüdükten sonra sütünün her litresinde yaklaşık 40 gr AAT salgılamaya başladı.

Tracy’den sonra Tracy’nin yavrularının sütünde protein salgılanması ve böylece sürekli üretim yapılması planlanıyordu.

Ancak bir problem vardı Tracy’den dünyaya gelen kuzular protein üretiminde anneleri kadar verimli değillerdi.

Tracy’ı genetik olarak kopyalayarak çoğaltmak ve yüksek verimde AAT üreten bir grup üretmek bir çözüm yolu olarak düşünüldü.

5 temmuz 1996 da Dolly meydana geldi.

Dolly’nin özelleşmiş bir hücrenin çekirdeği kullanılarak dünya gelmesi, tahmin edilenin aksine özelleşmiş bir hücre DNA’sının yeniden programlana bileceğini gösterdi.

1997 yılında Polly isimli koyun dünyaya geldi.

Polly sütünde hemofili hastalarında kullanılması amaçlanan pıhtılaşma faktörü IX’u salgılıyor.

TRANSGEN ANALİZİ

Bu bölümün amacı, bir transgenin genoma girişini; transgenin integre olup olmadığına, bütünlüğüne, kopya sayısına, giriş noktalarının sayısına ve ikili kopyaların oluşma eğilimine göre değerlendirmekte kullanılan tekniklerin ve yaklaşımların ana hatlarını belirlemektir.

Transgenik bir hayvanın belirlenmesi, transgenin bazı özelliklerinin belirlenmesini temel alır. Tasarlanan transgen birçok hallerde özel bir nükleik asit dizisi taşır. Bu özel DNA parçalan nükleik asit hibridizasyonuyla transgenik bir hayvanın belirlenmesini belirgin şekilde kolaylaştırır. Transgenin aynı kaynaktan elde edildiği ve bu sebepten dolayı da özel dizileri taşımadığı durumlarda ise alternatif stratejilerin uygulanması zorunluluğu doğar.

Transgenik bir hayvanın belirlenmesinde kullanılan ilkelerin hemen hemen değişmez olmasından dolayı, transgenin saptanmasında yararlanılacak metodoloji seçimleri üzerinde transgenin yapılandırılması sırasında durulmalıdır. Eğer yaklaşım açık ve anlaşılır değilse, konak hücre genomuna girişin saptanmasını sağlamak amacıyla transgen içine moleküler bir belirleyici (marker) sokulmalıdır. Bu moleküler belirleyici, hibridizasyon yoluyla tanımlamayı kolaylaştırmak için yabancı bir DNA parçası olabilir. Geçmişte, enjekte edilen transgenlerin çoğu transgenik “hayvanların belirlenmesinde kullanılan vektör dizileri taşırlardı. Bununla beraber, vektör dizilerinin transgenin ekspresyonunu büyük ölçüde azalttığı keşfedilmiş ve tek hücreli embriyolara enjeksiyondan önce transgendeki plazmid dizilerinin mümkün olduğu kadar uzaklaştırılması önerisi gündeme gelmiştir. Bu nedenle, bir DNA parçasının sokulması yerine, intronik dizilerden biri gibi transgen içerisinde bir bölgenin silinmesi üzerinde durulabilir. Fakat, söz konusu yöntem, ya ekspresyon düzeyinin ya da bölgesinin kontrolünden sorumlu önemli bir cis-etkili elementin silinmesi riskini de beraberinde getirir. Bu endişeler ışığında, en az riskli belirleyicinin, değiştirilmiş uygun bir restriksiyon enzim kesim bölgesi olduğu düşünülebilir. Bir restriksiyon noktasını değiştirmek veya gen içinde bir ya da birkaç bazı değiştirerek yeni bir tanesini yaratmak genellikle mümkündür. Kullanılan yöntem ne olursa olsun, transgenik hayvanların başarıyla tanımlanabilmesinde transgen dizaynının arkasında yatan mantık önemli bir rol oynamaktadır.

Eğer transgenik hayvan, yeni doğanın deri morfolojisindeki döküntü, kabartı veya epidermal kalınlaşma gibi erken dönemde saptanabilen farklı bir fenotipik değişikliğe sahipse, transgen DNA dizilerinin fiziksel varlığı için genotipik belirleme gerekli olmayabilir. Transgen tarafından teşvik edilen fenotipin saptanamadığı fakat mümkün olduğu kadar çabuk transgenik olan hayvanların belirlenmesinin gerektiği durumlarda, kolaylıkla belirlenebilen önemsiz ek bir fenotipik değişiklik yaratılabilir. İki doğrusal DNA parçası tek hücreli embriyo içine beraber enjekte (koenjeksiyon) edildiği zaman bu iki transgenin yüksek olasılıkla aynı lokusa girdiğinin gözlemlenmiş olmasından dolayı bu durumdan yararlanmak da olasıdır. Söz konusu gözlem, örneğin; ek olarak tirozinaz genini albino farelere yerleştirerek, pigmentli deri ve gözlerle doğan yavruların muhtemelen sadece tirozinaz genini değil, beraberindeki ilgili transgeni de taşıyor olması gibi, eğer biri girmişse diğeri de girmiş anlamına gelir. Günümüzde özellikle green fluorescent protein (GFP) geni de bu amaçla yaygın biçimde kullanılmaya başlanmıştır. Bu strateji, henüz embriyolar preimplantasyon dönemde iken transgenin varlığının tespit edilmesine olanak sağlayarak, özellikle çiftlik hayvanlarında uygulanacak embriyo transfer sayısını azalttığından dolayı büyük avantaj sağlamaktadır. Bununla birlikte, belirleyici konstraktın transkripsiyonel promotörünün diğer transgenin doku spesifikliğine karışmaması için tedbir alınmalıdır. Ek olarak, genoma beraberce girişin tüm vakalarda meydana gelmemesinden dolayı, doğrulama için genetik belirleme yapılması yoluna da gidilmelidir.

BİR TRANSGENİN DEĞERLENDİRİLMESİNDEKİ PARAMETRELER

Potansiyel transgenik bir hayvan için, transgenin varolup olmadığından ziyade sorulması gereken sorular şu şekilde olmalıdır;

 

        Transgen tam ve fonksiyonel mi?

        Hücre başına kaç giriş noktası var?

        Tek bir kromozoma! lokasyonda kaç transgen kopyası var?

        Çok sayıda transgen kopyası nasıl belirli bir kromozoma! bölgede düzenlenir?

        Transgen stabil bir genetik eleman şeklinde kalıtsal olarak aktarılabilir mi?

Transgenin konak hücre genomuna giriş mekanizmasının henüz tam olarak anlaşılmamasına rağmen, nadiren homolog rekombinasyon vasıtasıyla gerçekleştiği bilinmektedir. Transgen, giriş bölgesinde çoğunlukla multimerler halinde bulunur. Multimerizasyonun girişten önce mi gerçekleştiği yoksa transgenin giriş bölgesinde mi amplifiye olduğu bilinmemektedir. Hangisi olursa olsun, enjekte edilen parçanın her iki ucundaki diziler çoğu zaman kaybolmaktadır. Transgenin kısmi kopyalan farklı mekanizmalarla oluşturulmakta ve çeşitli uzunlukta transgen dizileri yaratılmaktadır. Bundan dolayı, enjekte edilen transgenin kromozomal lokustaki bütünlüğünü dikkatle analiz etmek şarttır.

Transgenin kopya sayılarının saptanması sadece basit bir laboratuar çalışması değildir. Teorik olarak, bir tek tam kopya yeterlidir. Bununla beraber, ekspresyon düzeyi ile gen dozajı arasında bağlantı vardır; yüksek kopya sayısı artan ekspresyon seviyesiyle sonuçlanır. Genelde bu gözlem tüm transgenler için geçerli değildir; aşın derecede yüksek kopya sayısı aslında düşük ekspresyon düzeyi ile de sonuçlanabilir. Yüksek bir kopya sayısı sadece ekspresyon düzeyini değil aynı zamanda transgenik lokusun genetik stabilitesini de etkiler. İkili tekrarlar gösteren elementlerin çok sayıda olması yeni düzenlenmeler, delesyonlar, kırılma ya da translokasyonlara sebep olan kromozom-içi rekombinasyon ile sonuçlanabilir. İki-beş kopyanın birçok amaç için ideal sayı olduğu deneyimlerle belirlenmiştir. Kurucu (founder) hayvanın transgeni bir kez karakterize edildikten sonra, stabil bir transgenik hattın kurulmasında seleksiyon yöntemi kullanılabilir. Birden fazla giriş noktasına sahip kurucu hayvanlar, iki lokusun ayrılmasına ve bağımsız hatların kurulmasına olanak tanımak amacıyla üretilmelidir. Tam ve bozulmamış bir transgen, ekspresyonu garanti etmez. Çalışması, kendisini kuşatan kromatin yapısı tarafından baskılanmış olabilir. Bundan dolayı, ekspresyon seviyesinin saptanması, üretimi sürdürülecek transgenik soyun seçilmesinde yardımcı olabilir. Gelişebilecek herhangi bir fenotipin doğrulanmasında ve olası sahte giriş-bölgelerinin kontrol edilmesinde birden fazla hat kullanılmalıdır. Transgen analizlerini ilgilendiren parametreler hakkında edinilecek ön bilgi, transgenik bir projenin dizaynı için kritik bir önem taşımaktadır.

TRANSGEN ANALİZİNDE KULLANILAN TEMEL YÖNTEMLER

A.Southern blot hibridizasyonu

Fareler genellikle, ya dövme yoluyla ya da kulakları veya tırnaklan kesilerek tanımlama için işaretlenebildikleri yaş olan 3 haftalıkken sütten kesilirler. Transgen analizi için kullanılacak DNA, kuyruk ucunun kesilmesiyle elde edilebilir. Kuyruk dokusu daha sonra doğranarak proteinaz K yardımıyla parçalanır. DNA, fenol-kloroform ekstraksiyonunu takiben etanol presipitasyonuyla elde edilebilir.

Tipik olarak, 10-20 µg DNA restriksiyon enzimiyle kesilir, agaroz jelde yürütülür, denatüre edilir, nötralleştirilir, nitroselüloz gibi bir membrana geçirilir ve transgene özel bir prob ile hibridize edilir. Herhangi bir endojen genle dizi homolojisi göstermeyen bir transgenin kopya sayısı ve yönünün belirlenmesi ile ilgili çalışma sonucu gösterilmiştir. Bunu yapmak için, transgen içinde sadece bir kez kesen bir restriksiyon enzimi seçilmiştir. Eğer bu tek noktadan kesen enzim molekülün bir tarafını daha fazla keserse, bu durum belirli bir giriş bölgesinde transgen yöneliminin saptanmasını kolaylaştıracaktır. İkili kopyalar baş-baş / kuyruk-kuyruk tarzında düzenlenir, o zaman asimetrik ve bir tek noktada-kesen enzimle kesim sonucu, birim uzunluğundan daha büyük ve daha küçük moleküller üretilir. Şayet giren kopyalar baş-kuyruk tarzındaysa, bu durumda aynı enzimle kesim sonucu 1 ve 2 no’lu kuyularda temsil edilen iki hayvanda da gözlendiği gibi birim uzunlukta moleküller üretilecektir (ok başı). Böyle hallerde, genoma giren kopyaların yönelimlerinin tanımlanmasından ‘çok, yapılan analiz ile aynı zamanda transgenin bütünlük derecesinin belirlenmesi de sağlanmaktadır.

 

Birim uzunluktaki molekülün boyutu, önceden aynı enzimle kesilen ve transgenik olmayan genomik DNA ile değiştirilmiş enjekte edilen DNA parçasının aynı jelde yürütülmesiyle saptanabilir.

 

Konakta birbirleriyle ilişkili kopya sayısına sahip transgenlerin analizi biraz daha karmaşıktır. Bu durumda, onları farklı şekilde ayırt edebilecek restriksiyon enzimler kullanılabilir.

 

Sadece, kodlayan dizi içerisinde değil, aynı zamanda, bir veya daha fazla sayıda genomik intron içerisinde de kesebilen enzimin seçimi, DNA parçalarının, Southern Blot analizinde konak- ya da transgen-kökenli olarak tanımlanmasına izin verecektir.

 

Tek bir Southern Blot analiziyle transgenin varlığı, bütünlüğü, kopya sayısı ve yönelimi saptanabilmektedir. Yaygın olarak kullanılan Slot Blot hibridizasyonu veya polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi tekniklerin hiçbiri Southern Blot ile karşılaştırıldığında aynı miktarda bilgiyi sağlayamamaktadır. Slot Blot hibridizasyon analizleri transgenin varlığını doğrulayabilir ve eğer doğru şekilde uygulanırsa yaklaşık kopya sayısı hakkında bilgilendirici olabilir; fakat transgenin bütünlüğü ve yönelimi noktalarında hiç de aydınlatıcı değildir. PCR ise, genellikle genlerin belirli bazı bölgelerini çoğaltır ve transgen varlığının doğrulanmasında kullanılır. Sadece semikantitatifle en iyisidir ve kopya sayısı ile bütünlük hakkında bazı bilgiler sağlar. Bu kısıtlamalara rağmen, elbette ki; Slot Blot hîbridizasyonu ve PCR analizleri transgenik hayvanların belirlenmesinde önemli rol oynar.

B.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

PCR, bir çeşit “in vitro klonlama” dir. PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyon) DNA’nın belli bir bölümünü ya da DNA’lar topluluğu içinde bir tip DNA yi çoğaltmak için geliştirilmiş bir yöntemdir. Bu teknikle, sentezlenecek DNA için gerekecek yapıtaşları (bazlar:A,T.C.G) po-limeraz enziminin yürüttüğü reaksiyon sonucu, DNA molekülündeki çoğaltılması istenen bölgenin kopyası olacak şekilde polimerize olur.

PCR, reaksiyonu DNA’nın iki zincirinin yüksek isi ile birbirinden ayrılmasını (denatürasyon); daha sonra sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA’ya bağlanmasını (hibridizasyonu); sonra zincirin uzamasını (polimerizasyonu) (çift iplikli DNA’ların sentezi) ve bu sikluslarin belirli sayida tekrarlanmasına dayanır. Bu üç adim (denatürasyon / primer bağlanması / DNA sentezi) bir PCR siklusunu oluşturur. Her adim farklı ısılarda gerçekleştirilir. (Sırasıyla 94°C-98°C; 37°C-65°C; 72°C ). PCR tekniği tek veya çift iplikçikli DNA’yı; RNA’ya hedef olarak kullanabilir.

 

Bu teknikle; bir DNA hedefini 106-1012 arasında çoğaltmak mümkündür. Yöntemin temeli, çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerine tamlayıcı bir çift sentetik oligonükleotid primer (18-20 baz uzunluğunda) kullanılarak; bu iki primer ile sınırlandırılan genin enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır.

 

PCR tekniği, çok az miktarda DNA ile çalışmaya olanak sağlamaktadır. PCR tekniği ile laboratuar tanısında çok büyük bir hız ve kesinlik kazanılmış; bir çok durumda radyoaktivite kullanımını gereksiz hale gelmiştir. PCR Teknolojisi için:

 

1)     DNA örneği, genelde genomik DNA,

2)     Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen bir çift sentetik

primer,

3)     dNTP’ler (A,T,C,G),

4)     Isıya dayanıklı DNA-Polimeraz enzimi,

5)     Uygun pH ve iyon koşullarını (Mg+2) sağlayan tampon karışımı

gereklidir.

 

PCR KULLANIM ALANLARI:

 

PCR’in başlıca kullanım alanları su şekilde sıralanabilir:

 

1. Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı,
2. Prenatal tanıda,
3. Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanması,
4. Adli tıpta,
5. Onkogenesisin araştırılmasında,
6. Probe’ların oluşturulmasında/klorlamada/gen ekspresyon

araştırmalarında,

7. DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin

oluşturulmasında,

8. Bilinmeyen dizilerin tayininde,
9. Geçmiş DNA’nın incelenmesi ve evrimin aydınlanmasında,
10. Restriksiyon Fragment Length Polimorfizm Analizinde,
11. Invitro fertilizasyon yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik

testlerin yapılması ve sonra implantasyon gerçekleştirilmesi ile bebeğin

normal doğmasının sağlanması,

12. DNA protein interaksiyonunun araştırılmasında (footprinting)

kullanılabilir.

1. Slot blot hibridizasyonu

PCR yöntemine benzer şekilde, Slot-Blot Hibridizasyon yönteminde de birçok kısıtlamalar ve zorluklar mevcuttur. Teknik, DNA’nın nitroselüloz bir membran gibi katı bir desteğe doğrudan uygulanmasını ve transgene özgü bir prob ile inkübasyonu kapsar. Southern Blot ile karşılaştırıldığında, Slot Blot analizleri DNA’nın restriksiyon enzimle kesimini gerektirmez ve bu nedenle de DNA örnekleri aşırı bir titizlikle saflaştırılmayabilir. Sonuç olarak prosedür, işlem süresini önemli ölçüde azaltacak ve daha fazla örneğin araştırılmasına izin verecektir. Bununla beraber, kesilmemiş DNA’nın kullanılmasıyla birlikte gelen yüksek vizkozluk, daha yüksek bir arka plan hibridizasyon sinyaline sebep olabilmektedir ve sonuç olarak, artan oranda yalancı pozitif sonuçlar ortaya çıkmaktadır. Bu teknik sahip olduğu bu avantajlarına rağmen, transgenin yönelimi ve bütünlüğüne dair bilgi verememektedir.